亚洲精品国产品国语在线观看丨久久成人麻豆午夜电影丨免费无码又爽又刺激高潮的视频丨国产欧美日韩精品丝袜高跟鞋丨久久国产亚洲精选av

內(nèi)容概述：本研究提出了一種將Cas12bsgRNA 拆分為兩個(gè)片段（即“分裂 sgRNA”）的策略。該策略利用通用骨架結(jié)構(gòu)與可定制的 Spacer 區(qū)域相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì) Cas12b 切割活性的精確調(diào)控。同時(shí)，此方法支持無需核酸擴(kuò)增的 microRNA 直接檢測(cè)。研究結(jié)果表明，通過優(yōu)化 sgRNA 結(jié)構(gòu)可有效降低脫靶效應(yīng)并抑制背景切割信號(hào)，從而構(gòu)建了一個(gè)具有高靈敏度和高特異性的 microRNA 檢測(cè)平臺(tái)。

研究背景

在基因編輯和核酸檢測(cè)領(lǐng)域，Cas12b是一種極具潛力的 CRISPR-Cas 系統(tǒng)。然而，傳統(tǒng) sgRNA 設(shè)計(jì)易引發(fā)背景切割和脫靶效應(yīng)，需更精細(xì)的活性調(diào)控策略。同時(shí)，作為重要生物標(biāo)志物的 microRNA，其檢測(cè)面臨濃度低、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等挑戰(zhàn)。為此，本研究旨在開發(fā)一種新型 sgRNA 架構(gòu)，在實(shí)現(xiàn)對(duì) Cas12b 活性精準(zhǔn)調(diào)控的同時(shí)，支持無需擴(kuò)增的 microRNA 直接檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)方法與過程

• sgRNA 分裂設(shè)計(jì)：將 sgRNA 拆分為 scaffold 部分與 Spacer 部分分別表達(dá)或組裝。

• 活性調(diào)控評(píng)估：通過體外Cas12b 切割實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不同組合，測(cè)定切割效率與背景活性。

• microRNA 檢測(cè)方案建立：結(jié)合報(bào)告片段和熒光信號(hào)輸出，無需逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增即可檢測(cè)目標(biāo) microRNA。

• 靈敏度與特異性測(cè)試：在多種microRNA 濃度梯度中測(cè)試檢測(cè)下限與選擇性。

  
  

Cas12b的sgRNA和分裂sgRNA的方案概述

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

• 活性調(diào)控：成功拆分sgRNA 顯著降低 Cas12b 的非特異背景切割，僅在配對(duì)正確 Spacer 后激活強(qiáng)信號(hào)。

• 高靈敏檢測(cè)：檢測(cè)下限達(dá)到picomolar 級(jí)別，背景噪音較低。

• microRNA 特異性良好：能區(qū)分近似序列差異較小的 microRNA，通過 Spacer 定制即可切換檢測(cè)目標(biāo)。

  
  

結(jié)論

split sgRNA 的設(shè)計(jì)具備普適性，只需更換 Spacer 即可擴(kuò)展至不同 microRNA 或 DNA 靶標(biāo)，且無擴(kuò)增的檢測(cè)方法可以簡(jiǎn)化流程、降低成本與污染風(fēng)險(xiǎn)。該平臺(tái)具備潛力推廣至臨床快速診斷設(shè)備或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)（POCT）應(yīng)用。未來可與納米載體、光學(xué)傳感設(shè)備等結(jié)合，提升整體檢測(cè)便利性與應(yīng)用范圍。

使用改良的CRISPR-Cas12b 系統(tǒng)檢測(cè) miR-17、21、31 和 92a 的表達(dá)量

使用同樣的檢測(cè)方法檢測(cè)健康人（H.D.1–5）、結(jié)直腸癌患者術(shù)前（P.D.1–5 preO） 和 術(shù)后（P.D.1–5 postO） 血漿總 RNA 中的 miR-17、21、31 和 92a 水平

Cas12b split sgRNA 方法 與傳統(tǒng) RT-qPCR 方法對(duì)比

論文中用到的NEST產(chǎn)品

胎牛血清

實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng)

涉及細(xì)胞類型：HCT116,SW480, NCM460

在本實(shí)驗(yàn)中，研究人員使用含FBS的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)了結(jié)直腸癌細(xì)胞系 HCT116、SW480 及正常腸上皮細(xì)胞系 NCM460，并從中提取 microRNA。隨后，他們利用開發(fā)的 split sgRNA-Cas12b 方法檢測(cè)了 miR-17、miR-21、miR-31 和 miR-92a，并與傳統(tǒng) RT-qPCR 結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，癌細(xì)胞中 microRNA 表達(dá)量顯著高于正常細(xì)胞，兩種方法結(jié)果高度一致。此外，還檢測(cè)了結(jié)直腸癌患者術(shù)前術(shù)后及健康人群血漿中的 microRNA 水平，驗(yàn)證了其在腫瘤診斷和術(shù)后監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用潛力。

NEST胎牛血清的優(yōu)勢(shì)

NEST胎牛血清是從牛胎中抽取的血液凝固后剩余的液體部分，通過離心去除細(xì)胞、凝固纖維蛋白原和蛋白以得到血清，含有許多有助于細(xì)胞生長(zhǎng)的成分，包括：如生長(zhǎng)因子、附著因子、激素、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、脂質(zhì)、糖類、維生素等。