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2023-02-086147 次瀏覽
解決方案|PBMC分離小妙招

PBMCperipheral blood mononuclear cell),外周血單個核細胞,其主要細胞類型為血液里具有單個核的細胞,主要包括淋巴細胞(T\B),單核細胞,吞噬細胞,樹突狀細胞和其他少量細胞類型,其中淋巴細胞占很大一部分。分離PBMC的主要目的是為了將多核細胞和紅細胞去除,從而能夠很方便地模擬體外的血液免疫環(huán)境。從血液制備PBMC是分離特定免疫細胞亞群之前常見的一個步驟。最常用的PBMC分選方法是使用密度梯度離心液進行離心。

工具/原料

  • 全血 (以10ml為例)
  • 無菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理鹽水
  • 蔗糖溶液(Ficoll Pague PLUS)
    • 外周血淋巴細胞分離管

    方法/步驟

    1.  將分離液用移液管從分離管嵌套的中心孔中加入:15ml的分離管需要加入約4ml分離液;50ml的分離管需要加入約13ml分離液,確保分離液覆蓋嵌套上方。

    2.  將抗凝樣本沿管壁緩慢倒入或用移液管沿管壁緩慢加入到分離管中。

    3.  室溫下離心10min,離心力為1200 x g

    4.  收獲PBMC細胞,將分離管中上清倒入另一干凈離心管中,分離管中的嵌套能有效避免紅細胞和粒細胞再次污染。(注意:離心后傾倒收獲細胞前,也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層,有助于減少細胞被血小板污染。

    5.  PBS洗滌PBMC細胞,在250 x g離心力下離心10min。

    6.  按步驟5重復洗滌2次,用5ml PBS緩沖液重懸細胞。


    離心后液體分離情況(從上到下):a血漿層;b富集的細胞部分(PBMCs);c分離液;d嵌套;e沉淀(紅細胞和粒細胞)。

    注意事項

    1.  可用于人類外周血、骨髓和臍帶血樣本。不適用于血凝等異常樣本或超過48小時的樣本。

    2.  15ml的分離管建議使用4-9ml樣本;50ml的分離管建議使用13-30ml樣本。

    3.  對于放置24h以上的樣本,建議離心時間加長。

    4.  離心后收獲細胞前,也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層,有助于防止被血小板污染。

    5.  離心后傾倒上清時不要將分離管倒置2s以上。

    6.  分離管請勿重復使用。

    7.  離心后,細胞可能聚集在富集層以上的分離管的管壁上。這種聚合是正常的,受樣本質(zhì)量、樣本放置時間和抗凝劑類型的影響。此聚合與分離管的使用無關。細胞可以通過使用移液管尖端輕刮聚集團的一側(cè)來清除。

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